Materiais
Protocolos para experiências de germinação
Miguel Ângelo Carvalho, Centro de Ciências Geológicas e Biológicas, Universidade da Madeira
Protocolo tipo para o Ensino Secundário
Objectivos:
Observar alterações na germinação das sementes submetidas a condições extremas (oscilações de temperatura, imponderabilidade, radiações UV).
Observar alterações nos parâmetros bioquímicos da semente antes e durante a germinação.
Planta: Hypericum glandulosum Ait.
Procedimento experimental
I. Pesar as sementes controle e as experimentais. Colocar cada uma das sementes num eppendorf e realizar a sua maceração, na presença de areia de quartzo e de uma solução tampão (0,1 M Tris, pH 7,5, 0,1 triton X-100, 1% SDS), esta última na proporção de 1:10 (p/v).
II. Centrifugar o conteúdo dos eppendorfs , numa centrifuga refrigerada, durante 5 minutos, à velocidade de 10.000 rpm.
III. Aproveitar o sobrenadante para dosear proteínas (método de Lowry), lípidos (kit de lípidos totais da Sinpreact) ou glúcidos (método da antrona).
IV. O sobrenadante pode ser utilizado para (caso seja possível realizar a separação electroforética das proteínas totais em condições desnaturantes, método de Laemmly).
V. Preparar 2 tabuleiros (A e B) com 20 cm por 5 cm de altura, revestindo-os com 2 camadas de papel de filtro (ou algodão ou papel absorvente de cozinha), humedecendo bem o papel com água destilada.
VI. Desinfectar as sementes, durante 30 minutos, em 1% de hipocloreto de sódio (lixívia, 1 ml de lixívia em 99 ml de água), seguido da sua hidratação em água, durante 30 minutos adicionais.
VII. Lançar 8 a 12 sementes em cada tabuleiro A (sementes controle que permaneceram em terra) e B (sementes experimentais que participaram no voo espacial). Cobrir bem os tabuleiros com papel de alumínio e colocá-los numa câmara de crescimento, a temperatura de 25 ºC. Os tabuleiros devem ser observados e se necessário regados todos os dias.
VIII. Registar o dia e a hora de início da experiência, num caderno de “laboratório”.
IX. Recolher 2 sementes de cada tabuleiro, ao fim de 24 horas e realizar os procedimentos experimentais dos pontos 1 a 4.
X. Registar o dia de aparecimento da raíz e do hipocótilo. Vinte e quatro horas após este aparecimento recolher 2 sementes de cada tabuleiro e realizar os procedimentos experimentais dos pontos 1 a 4.
XI. Recolher mais 2 sementes de cada tabuleiro, 72 horas após o aparecimento da raíz e do hipocótilo e realizar os procedimentos experimentais dos pontos 1 a 4.
XII. Manter as restantes sementes em crescimento e fazer a mesma análise às folhas recolhendo a 1ª folha 24 horas após o seu aparecimento, a 2ª folha 48 horas após o seu aparecimento e a 3ª folha 72 horas após o seu aparecimento.
XIII. A experiência de germinação (caso existam sementes suficientes) podem variar em termos de fotoperíodo (presente ou ausente). O fotoperíodo pode ser importante para observar diferenças no comportamento de plantas, cujas sementes foram submetidas às condições de imponderabilidade.
XIV. Caso não seja possível realizar os procedimentos experimentais previstos nos pontos 1 a 4, as experiências podem basear-se na simples observação das diferenças entre as plantas controle e experimentais, durante a germinação, através da medição do aumento de comprimento das partes vegetativas ou do peso das plântulas com o tempo, em diferentes condições experimentais (diferentes temperaturas de crescimento 15 e 25 ºC, presença ou ausência do fotoperíodo).
XV. Apresentar os resultados sob a forma de média e em gráfico. Interpretar os resultados e tirar conclusões sob a influência dos factores de imponderabilidade sob a germinação e o crescimento do Hypericum glandulosum Ait..